分子印跡技術(shù)是制備空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)與模板分子完全匹配的聚合物的技術(shù)，通過模板分子與具有官能團(tuán)的功能單體相互作用，在交聯(lián)劑的存在下引發(fā)聚合，形成大孔、網(wǎng)狀的聚合物，進(jìn)而除去模板，在聚合物中形成與模板分子空間匹配的具有多重作用位點(diǎn)的印跡孔穴，得到分子印跡聚合物(MIP)。在大多數(shù)情況下，分子印跡聚合物的特異性識(shí)別位點(diǎn)是通過一種模板分子而產(chǎn)生的，然而分子印跡聚合物的制備過程卻可以不局限于使用單一的模板分子，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)印跡多種組分。Sreenivasan 等制備了水楊酸和氫化可的松為模板分子的印跡聚合物，該聚合物對兩種模板均呈現(xiàn)出選擇性結(jié)合。不久，該研究小組又制備了具有類似效果的以膽固醇、睪酮和氫化可的松為模板的三重模板印跡聚合物。Dickert 等在制備兩種模板同時(shí)印跡的交聯(lián)聚氨酯薄膜時(shí)，提出了“雙重分子印跡(double molecularimprinting)”的概念。多模板印跡的優(yōu)點(diǎn)在于可以同時(shí)提取、分離、分析和檢測同一樣本中多種目標(biāo)分析物，而單一印跡聚合物則主要對一種模板分子具有選擇性識(shí)別能力。這些關(guān)于雙/ 多模板印跡的報(bào)道主要集中在小分子印跡聚合物上，由于生物大分子蛋白質(zhì)具有龐大的分子體積、復(fù)雜多變的構(gòu)象及對環(huán)境非常敏感等特點(diǎn)，制成蛋白質(zhì)印跡的難度較大，而制成雙蛋白質(zhì)印跡聚合物的難度就更大了，也更鮮有了。

　　目前對蛋白質(zhì)印跡多采用表面印跡法，在開發(fā)新的印跡方法如光接枝聚合法或引入新的印跡功能單體如丙烯酰基-β-環(huán)糊精時(shí)，文獻(xiàn)中多使用溶菌酶(Lyz)做模板蛋白質(zhì)。Lyz(13. 4 kDa，pI11. 2)的相對分子質(zhì)量較小，它廣泛存在蛋清、淚液、唾液及其他體液中，是肺結(jié)核、真菌腦膜炎等各種疾病診斷的重要指標(biāo)。而牛血清白蛋白(BSA，66. 0 kDa，pI 4. 9)是牛血清中的主要成分，主要用于生化及醫(yī)藥研究，相對分子質(zhì)量較大，對大蛋白質(zhì)的印跡過程中，通常用到除氫鍵之外的蛋白質(zhì)與單體間其他較強(qiáng)的相互作用[19]，或直接將較大蛋白質(zhì)共價(jià)接枝到載體基質(zhì)表面來實(shí)現(xiàn)成功印跡。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)是一種可控的自由基活性聚合反應(yīng)，與傳統(tǒng)的自由基聚合反應(yīng)相比，ATRP 的反應(yīng)條件溫和，無需加熱和紫外光照，室溫下可在水介質(zhì)中發(fā)生反應(yīng)，能夠避免不均勻反應(yīng)等逆向反應(yīng)和溶膠凝膠現(xiàn)象，適于蛋白質(zhì)的分子印跡。本文在以往工作的基礎(chǔ)上，采用ATRP法，以兩種相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)差異較大的蛋白質(zhì)——BSA 和Lyz 作為模板蛋白質(zhì)，制備了雙模板蛋白質(zhì)表面印跡的聚合物(Bi-MIP)，考察了Bi-MIP制備過程中輔助功能單體的加入量對模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 印跡效果的影響，通過靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，對Bi-MIP 吸附雙模板蛋白質(zhì)的吸附性能進(jìn)行了研究。

　　1 實(shí)驗(yàn)部分

　　1. 1 儀器與試劑

　　日本島津高效液相色譜儀(HPLC)(LC-20A)。Lyz 和BSA(Amresco 公司);牛血清樣品(廣州鑫特生物制品有限公司);雞蛋清樣品由新鮮雞蛋在冷凍離心機(jī)中以10 000 r / min 離心30 min 的上清液得到，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

　　N-異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)(Acros Organics公司);丙烯酰胺(AAm)和N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA)(Sigma-Aldrich 公司);N-(3-二甲氨基丙基)甲基丙烯酰胺(DMAPMA)(日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社);N，N，N′，N′，N″-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)(Alfa Aesar 公司);CuCl(氮?dú)獗Ｗo(hù)下在乙酸中進(jìn)一步提純，北京市精細(xì)化學(xué)品有限公司);三氟乙酸(化學(xué)純，北京化工廠);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher ChemAlert 公司);四氫呋喃和三乙胺(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限公司);2-溴代異丁酰溴(北京偶合科技有限公司);以上試劑除有特別說明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

　　1. 2 雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物的制備

　　據(jù)文獻(xiàn)，用水熱法制備Fe3O4粒子，接著采用溶膠凝膠法對Fe3O4粒子包覆硅層，得到Fe3O4@ SiO2。將Fe3O4@ SiO2分散在四氫呋喃和三乙胺的混合溶液中，在冰浴中對該體系反復(fù)抽真空和充高純氮?dú)? 次，再逐滴加入2-溴代異丁酰溴，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫震蕩反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，洗滌干燥產(chǎn)物，得到引發(fā)劑修飾的Fe3O4納米粒子(Fe3O4@initiator)。

　　采用ATRP 法，在Fe3O4@ initiator 表面得到輔助功能單體DMAPMA 加入量不同的Bi-MIP 和非印跡聚合物(NIP)，模板蛋白質(zhì)和單體的量見表1。圖1 為ATRP 法制備Bi-MIP 的示意圖。具體制備方法以Bi-MIP-2 為例：在100 mL 的三頸圓底燒瓶中加入0. 2 g Fe3O4@ initiator，將其分散在20mL 0. 01 mol / L 磷酸緩沖溶液(PBS，pH 7. 0)中，加入0. 40 g 單體NIPAAm，0. 01 g 單體AAm，10μL 輔助單體DMAPMA，0. 005 3 g 交聯(lián)劑MBAA，0. 05 g 模板蛋白質(zhì)BSA，0. 01 g 模板蛋白質(zhì)Lyz 和30 μL PMDETA，在振蕩器上預(yù)聚合12 h。然后，對該混合體系抽真空20 min，接著向瓶中充入高純氮?dú)?0 min，該過程反復(fù)3 次后，將15 mg CuCl 快速轉(zhuǎn)入燒瓶中，此時(shí)，CuCl / PMDETA 構(gòu)成催化體系，在引發(fā)劑Fe3O4@ initiator 作用下引發(fā)ATRP 反應(yīng)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫震蕩反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，磁性分離，收集產(chǎn)物，并用1 mol / L NaCl 和二次水反復(fù)洗滌。產(chǎn)物干燥后，即得到Bi-MIP。NIP 的制備除不加模板蛋白質(zhì)之外，其余步驟同上。

　　1. 3 雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物對蛋白質(zhì)的吸附實(shí)驗(yàn)

　　考察了制備過程中功能單體的量對雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物吸附單一模板蛋白質(zhì)和兩種混合模板蛋白質(zhì)的影響。稱取2. 0 mg 不同的印跡聚合物置于離心管中，用緩沖溶液(0. 01 mol / L，pH 7. 0PBS)平衡后，加入1 mL 蛋白質(zhì)溶液(分別為0. 4mg / mL BSA 溶液、0. 2 mg / mL Lyz 溶液和含有0. 4mg / mL BSA 與0. 2 mg / mL Lyz 的混合溶液)，25℃下振蕩吸附12 h。磁性分離聚合物后，吸取上清液。用HPLC 測定吸附前后的蛋白質(zhì)的濃度。測定雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物對每一種目標(biāo)蛋白質(zhì)的靜態(tài)平衡吸附容量，稱取2. 0 mg 印跡聚合物置于離心管中，用緩沖溶液平衡后，加入已知濃度的BSA 溶液和Lyz 溶液，25 ℃下振蕩吸附12h。磁性分離聚合物后，吸取上清液。用HPLC 測定吸附前后的蛋白質(zhì)的濃度。考察了雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物對實(shí)際樣品中模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 的吸附性能。取5. 0mg 印跡聚合物置于離心管中，用緩沖溶液平衡后，加入1 mL 20 倍稀釋的實(shí)際樣品(1 ∶1(體積比)混合的牛血清與雞蛋清樣品)，25 ℃下振蕩吸附12h。磁性分離聚合物后，吸取上清液。用HPLC 測定吸附前后的蛋白質(zhì)的濃度。

　　1. 4 蛋白質(zhì)濃度的測定

　　所有蛋白質(zhì)濃度均由HPLC 測定。色譜條件如下：C8 色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm，30 nm)(安捷倫科技有限公司);流動(dòng)相A 為0. 1% (v / v)三氟乙酸的80% (v / v)乙腈水溶液，流動(dòng)相B 為0. 1% (v / v)三氟乙酸水溶液;線性梯度洗脫：在20min 內(nèi)流動(dòng)相A 由37. 5% 升高到62. 5% ;紫外檢測波長214 nm;流速1. 0 mL / min;進(jìn)樣體積10 μL;柱溫35 ℃。

　　1. 5 吸附容量的測定

　　吸附容量(Q)由吸附前后溶液中蛋白質(zhì)濃度的變化、溶液體積和聚合物質(zhì)量計(jì)算得到。Q 定義為每單位質(zhì)量聚合物的吸附容量(mg / g)，由下式計(jì)算：Q= (C0-Cf)V /m (1)式中，C0為初始蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg / mL)，Cf為吸附之后的最終蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg / mL)，V是蛋白質(zhì)溶液的體積(mL)，m 是聚合物的質(zhì)量(g)。

　　2 結(jié)果與討論

　　本文主要考察雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物的吸附性能，對該印跡聚合物的分析表征將在其他工作中考察。

　　2. 1 堿性單體濃度不同的印跡聚合物對模板蛋白質(zhì)的吸附

　　堿性單體DMAPMA 有助于酸性大的蛋白質(zhì)BSA 的印跡。在pH 7. 0 的印跡聚合物的制備溶液中，功能單體NIPAAm 和AAm 通過氫鍵作用排列到模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 周圍，此時(shí)堿性單體DMAPMA 與Lyz 均帶正電荷，存在斥力，而帶正電的堿性單體DMAPMA 通過靜電引力都自組裝到帶負(fù)電荷的BSA 表面。之后，制備溶液發(fā)生原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)得到雙模板蛋白質(zhì)印跡聚合物，該印跡聚合物經(jīng)模板洗脫、干燥后，形成了與模板BSA 的形狀、氫鍵和離子間相互作用互補(bǔ)的BSA 印跡孔穴及與模板Lyz 的形狀和氫鍵作用互補(bǔ)的Lyz印跡孔穴。其中堿性單體DMAPMA 的量直接關(guān)系到能否同時(shí)印跡BSA 和Lyz，并影響制備得到的印跡聚合物對BSA 和Lyz 的選擇性。

　　2. 1. 1 對模板蛋白質(zhì)BSA 的吸附

　　堿性輔助單體DMAPMA 加入量不同時(shí)制備的雙模板蛋白質(zhì)表面印跡的聚合物對模板蛋白質(zhì)BSA 的吸附容量圖。當(dāng)堿性單體的量從0 μL 增加到30 μL 時(shí)，Bi-MIP 對BSA 的吸附容量隨著堿性單體加入量的增加而增加。印跡聚合物的制備過程中堿性單體的量越多，其與BSA 之間的靜電作用越強(qiáng)，吸附容量越大。但由表2 可知，Bi-MIP 對BSA 的選擇性(αs，BSA)隨著堿性單體的量的增加先增大后減小。這是因?yàn)檫m量的堿性單體與模板蛋白質(zhì)之間形成的穩(wěn)定配合物，有利于印跡過程中模板蛋白質(zhì)印跡孔穴的形成;當(dāng)堿性單體量超過一定值時(shí)，形成的印跡聚合物與模板蛋白質(zhì)之間表現(xiàn)為較強(qiáng)的靜電吸附，掩蓋了印跡聚合物對模板蛋白質(zhì)之間的印跡作用，表現(xiàn)為印跡聚合物的選擇性降低。因此，堿性單體DMAPMA 量為20 μL 時(shí)制備得到的Bi-MIP-3，對模板蛋白質(zhì)BSA 有較好的吸附容量和選擇性。

　　2. 1. 2 對模板蛋白質(zhì)Lyz 的吸附

　　堿性單體DMAPMA 加入量不同時(shí)制備的雙模板蛋白質(zhì)表面印跡的聚合物對模板蛋白質(zhì)Lyz 的吸附容量圖。當(dāng)堿性單體量從0 μL 增加到30 μL 時(shí)，Bi-MIP 對Lyz 的吸附容量隨著堿性單體加入量的增加而減小。制備印跡聚合物過程中所用堿性單體量越多，其與Lyz 之間的靜電斥力越強(qiáng)，吸附容量越小。由表2 可知，Bi-MIP 對Lyz 的選擇性(αs，Lyz)隨著堿性單體量的增加而減小。當(dāng)堿性單體量達(dá)到30 μL 時(shí)，Bi-MIP-4 對Lyz 無印跡作用，可能因?yàn)楦邼舛鹊膲A性單體使制備過程中與其帶相同電性的模板蛋白質(zhì)Lyz 難以接近載體，無法形成對Lyz 的印跡。

　　2. 1. 3 對雙模板蛋白質(zhì)混合溶液中蛋白質(zhì)的吸附

　　堿性單體DMAPMA 的量分別為10 μL和20 μL 時(shí)制備的Bi-MIP-2 和Bi-MIP-3 對雙模板蛋白質(zhì)混合溶液中BSA 和Lyz 的吸附容量圖。在堿性單體量較大時(shí)，Bi-MIP 對混合溶液中BSA 和Lyz 吸附容量的變化符合其對單一模板蛋白質(zhì)BSA和Lyz 的吸附容量變化趨勢，即對BSA 的吸附容量隨單體量的增加而增加，對Lyz 的吸附容量隨單體量的增加而減小。與2. 1. 1 和2. 1. 2 節(jié)的結(jié)果相比，Bi-MIP-2 和Bi-MIP-3 對混合溶液中BSA 和Lyz的吸附量均減小，且由表2 可知，其對BSA 和Lyz選擇性因子均增加。結(jié)果表明，在雙模板蛋白質(zhì)的混合溶液中，兩種蛋白質(zhì)同時(shí)存在雖然對Bi-MIP 吸附每一種蛋白質(zhì)有抑制作用，對BSA 和Lyz 的吸附容量降低，但是增強(qiáng)了Bi-MIP 中BSA 印跡孔穴和Lyz 印跡孔穴對各自目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性。

　　基于以上結(jié)果可知，堿性輔助功能單體DMAPMA 為20 μL 時(shí)制備得到的Bi-MIP-3 對雙模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 有較好的吸附容量與選擇性。2. 2 Bi-MIP 對模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 的吸附等溫線研究了Bi-MIP-3 對單一模板蛋白質(zhì)溶液中模板蛋白質(zhì)的吸附等溫線。使用靜態(tài)平衡吸附法，分別測定了Bi-MIP-3 和NIP-3 對BSA(質(zhì)量濃度范圍為0. 1 ～ 0. 4 mg / mL)和Lyz(質(zhì)量濃度范圍為0. 1～ 0. 4 mg / mL)的吸附結(jié)合量，用Langmuir 吸附方程評價(jià)分子印跡聚合物的結(jié)合特性，Langmuir 吸附方程如下：Ce / Q=Ce / Qmax+1 / (KQmax)(2)式中Q 和Qmax分別是聚合物對模板蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)吸附容量(mg / g)和最大理論吸附容量(mg / g)，Ce為吸附平衡后溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度(mg / mL)，K 為聚合物對模板蛋白質(zhì)吸附的Langmuir 吸附平衡常數(shù)(mL / mg)。以Ce / Q 對Ce分別作圖得到Bi-MIP-3 和NIP-3 對模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 的吸附等溫線，根據(jù)擬合直線的斜率和截距計(jì)算得到BSA 和Lyz分別在Bi-MIP-3 和NIP-3 上的吸附平衡常數(shù)(K)和最大吸附容量(Qmax)。由表3 可知，BSA 和Lyz在Bi-MIP-3 上的Qmax高于在NIP-3 上的Qmax。結(jié)果表明，以BSA 和Lyz 為模板制備的雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物具有特異性識(shí)別BSA 和Lyz 的識(shí)別位點(diǎn)，Bi-MIP-3 對模板蛋白質(zhì)BSA 和Lyz 具有較高的親和性。

　　2. 3 Bi-MIP 用于分離實(shí)際樣品中的模板蛋白質(zhì)

　　考察了Bi-MIP-3 在實(shí)際樣品中對目標(biāo)蛋白質(zhì)的吸附能力。牛血清和雞蛋清樣品的混合溶液作為BSA 和Lyz 的混合蛋白源。峰1 和峰2分別是標(biāo)準(zhǔn)Lyz 和BSA 的色譜峰。20 倍稀釋的1 ∶1(體積比)混合的牛血清和雞蛋清樣品的色譜圖。當(dāng)混合實(shí)際樣品被Bi-MIP-3 吸附分離后，上清液中的Lyz(峰1)和BSA(峰2)的峰高明顯降低，而未知蛋白質(zhì)的色譜峰(峰3和峰4)沒有明顯的變化。以上結(jié)果表明，Bi-MIP-3對牛血清與雞蛋清樣品的混合溶液中的BSA 與Lyz有較好的識(shí)別選擇性，并對共存的其他蛋白質(zhì)不存在交叉選擇性。

　　3 結(jié)論

　　本文對混合蛋白質(zhì)模板印跡技術(shù)進(jìn)行了初探。通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法，在適量堿性功能單體存在下制備了BSA 和Lyz 為雙模板蛋白質(zhì)的表面印跡聚合物。該雙模板蛋白質(zhì)表面印跡聚合物在單一蛋白質(zhì)溶液、混合蛋白質(zhì)溶液及實(shí)際樣品中對模板蛋白質(zhì)均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力和較好的印跡效果，有望應(yīng)用于雙/ 多目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離與識(shí)別。同時(shí)，該印跡聚合物的制備也為以其他雙/ 多目標(biāo)蛋白質(zhì)為模板的識(shí)別材料的研制開發(fā)提供了思路。